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【标准解析】CDE 纳米药物质量控制研究技术指导原则解读
2097 人阅读发布时间：2022-01-05 13:59
#本文由马尔文帕纳科应用专家张鹏博士供稿#
为规范和指导纳米药物研究与评价，在国家药品监督管理局的部署下，药审中心组织制定了《纳米药物质量控制研究技术指导原则（试行）》、《纳米药物非临床药代动力学研究技术指导原则（试行）》《纳米药物非临床安全性评价研究技术指导原则（试行）》三项关于纳米药物研究、质控、评价的技术指导原则。并由经国家药品监督管理局审查同意，8月27日予以发布通告，三项技术指导原则自发布之日起开始施行。
其中《纳米药物质量控制研究技术指导原则》主要内容是围绕着纳米药物的安全性、有效性以及质量可控性展开的。在这3方面，质量的可控性显得尤为重要，它一定程度上决定了药物的安全性和有效性。
该指导原则进一步将纳米药物细分为三类：药物纳米粒、载体类纳米药物以及其他类纳米药物，前两类药物适用于该指导原则。
在研发过程中，纳米药物的质量控制指标又可以分为纳米相关特性和制剂基本特性两大类。其中纳米相关特性是可能与药物在体内行为息息相关的重要质量指标。又包括例如平均粒径及其分布、纳米粒结构特征、微观形态、表面性质（电荷、比表面积等）包封率、载药量、纳米粒浓度、纳米粒稳定性等等。
质量控制指标涉及方面较多，本文重点关注以下三个方面的指标：
1. 粒径（平均粒径及其分布）
2. 表面电荷
3. 纳米粒浓度
在粒径表征方面，该指导意见原文如下：
「应选择适当的测定方法对纳米药物的粒径及分布进行研究，并进行完整的方法学验证及优化。粒径及分布通常采用动态光散射法（Dynamic light scattering，DLS）进行测定，需要使用经过认证的标准物质（Certified reference material，CRM）进行校验，测定结果为流体动力学粒径（Rh），粒径分布一般采用多分散系数（Polydispersity index，PDI）表示。除此之外，显微成像技术（如透射电镜（Transmission electron microscopy，TEM）、扫描电镜（Scanning electron microscopy，SEM）和原子力显微镜（Atomic force microscopy，AFM）、纳米颗粒跟踪分析系统 (Nanoparticle tracking analysis, NTA)、小角 X 射线散射（Small-angle X-ray scattering，SAXS）和小角中子散射（Small-angle neutron scattering，SANS）等也可提供纳米药物粒径大小的信息。对于非单分散的样品，可考虑将粒径测定技术与其它分散/分离技术联用。」
在了解动态光散射技术（DLS）之前，我们先来讲一讲粒径测量时的「等效球体」的概念。
想象一下，当我们完成颗粒粒径测试后，该如何用准确的数值来描述这些三维颗粒的大小呢？当颗粒是规则的形状时，比如说正方体、球体，我们可以用一个数值，例如：边长、直径，来表示这个颗粒的大小；但是，当颗粒呈现的形貌是无规则的话，我们就无法用一个数值来描述这个颗粒大小了，那有人会说，用一系列数值来描述这些颗粒不就行了吗，这个方法确实可行，但是随之带来了数据呈现的复杂度以及颗粒粒径大小比较的困难度。这个时候我们就必须引入「等效球体」概念了。
什么叫做等效球体呢？
当我们通过某种技术测量颗粒在某一方面的性质，并得到了一个具体的数值，如果一个刚性球体在该性质方面的数值和前者一样，那么我们就认为待测物的颗粒大小和这个刚性球的大小一致。
等效球体概念在粒径上的应用既能满足准确表示待测颗粒的粒径大小，又能使得这些数值能够被用来进行大小比较（单个数值）。
如图1 所示，我们可以得知，当一个不规则的颗粒采用不同的测量技术（沉降法、电阻法、体积法等等）去进行测量时，往往会得到不同的粒径值。
而我们说的动态光散射技术测量的是颗粒的扩散速度，所以，具有同样大小扩散速度的刚性球体的直径就是待测颗粒的粒径大小，我们一般称之为流体力学直径。
动态光散射
接着我们进一步来了解一下什么是 DLS 技术：
分散在溶液相的纳米颗粒由于受到溶剂分子的撞击，呈现出无规则的运动，我们称之为布朗运动（Brownian motion），如果我们将一束激光照射至含有该纳米颗粒的溶液中，溶液相中的颗粒会产生散射光，随后在一定的角度收集相关的散射光，我们就能得到如图2 所示的散射光强随时间的变化曲线，可以看出大颗粒布朗运动较为缓慢，散射光强的变化频率较慢（图2，上）。小颗粒则相反，由于其布朗运动剧烈，接收到的散射光强的变化频率较快（图2，下）。
而动态光散射技术则可以捕获上述散射光变化的频率，进而获得颗粒的布朗运动速率大小，最后通过反演算法获得颗粒的粒径和分布。
根据斯托克斯-爱因斯坦方程（Stokes-Einstein）的定义，我们可以看出，颗粒的运动速率是和它的粒径成反比的，运动速率越快，粒径越小，运动速率越慢，粒径越大。
该方程式：DH=KT/3πηD
K：玻尔兹曼常数
T：整个体系的绝对温度值
η：溶剂粘度值
D：颗粒平动扩散系数
那具体如何获得颗粒的布朗运动速率(D)呢？
接下来我们要引入「相关性」这个概念，如图3所示，如果我们将 t 时刻的散射光强度和其后较长时间的散射光强相比较，显然，他们没有什么相关性。但是，当我们将时间缩短至极短时间范围内，也就是将 t 和 t+δt 时刻的光强值进行比较，就能得到很强的相关性，随着时间的增加（δt, 2δt, 3δt, 等等)，其散射光强值和t时刻的相关性不断衰减，最后接近0值，相关性通常用数值来描述（1→0），数值越靠近「1」代表相关性非常高，越接近「0」代表相关性很低。δt 的时间非常短，一般在纳秒（nanosecond，ns）或者微秒（microsecond，μs）。
散射光强在不同时间点的相关性我们用 G (τ) 来表示：G (τ)=A[1+Bexp (-2Γτ)]
τ 代表着信号采集滞后时间
Γ=Dq2，
q=(4πn/λ0) sin(θ/2)，散射矢量
D：颗粒平动扩散系数
n：溶液的折光指数
λ0：入射光波长
θ：散射光接收角度
最后，我们用相关方程来描述这种相关性随时间的变化（图4），大颗粒的散射光强的相关性随时间变化慢，信号衰减慢（左），小颗粒的散射光强的相关性随时间变化快，信号衰减快（右）。
聊完了 DLS 的基本原理，我们再来看看大家比较关注的几个问题：
1. 什么是 Z-average size（平均粒径）、PI（polydispersity index，多分散指数）？
Z-average size 表示样品中颗粒的平均粒径大小，根据 ISO 13321:1996，我们可以知道，该数据是通过累计分析法得到的。
PI 代表着样品的粒径分布宽度，数值越小，说明体系里的粒径大小越一致，数值越大，说明体系里的粒径分布群体越多，粒径分布较宽，一般我们认为当 PI 值大于 0.7 时，表示这个体系不再适合用 DLS 这种技术进行表征了。
除了平均粒径和 PI，我们还能得到颗粒的光强粒径分布图，在这个分布图里，我们能得到不同粒径下对应的散射光强占比数据，这些分布图是根据分布算法得到的。
2. 如何看待不同测量角度下得到的粒径数据？
市面上主要存在两种测量角度的纳米粒度仪，分别是 90° 和 173°，前者我们称之为侧向角，后者我们称之为背向角。
当测试的样品为粒径窄分布时，例如聚苯yi烯标准样品，两种测量角度都能得到很好的粒径分布图，结果也非常一致（图5）。
当测试的样品为粒径宽分布时，比如一些生物样品，两种测量角度得到的粒径分布图就会有区别（见图6）。
这是为什么呢？
这其实是和颗粒的散射性质有关系的，当颗粒的粒径大小小于入射波段的 1/10 时，颗粒在各个方向上的散射光强度都一样，我们称之为各向同性，那么在这两个角度上进行测量，都能得到正确的数值。但是随着颗粒粒径的增加，颗粒在各个方向上的散射光强开始变得不一致，越靠近 0 度角，其散射光强增加越强烈，我们称之为各向异性。在绝大多数情况下，不同粒径的颗粒其散射强度在 90° 要比在 173° 要强一些，当体系中大颗粒开始变多时，来自于大颗粒的散射光强贡献度在 90° 角下就会比在 173° 角下要更多，因为粒径分布的数据是根据不同粒径的散射光强在整个体系的占比中得到的，所以在 90° 角下会使得颗粒的粒径分布更容易倾向于体系中存在的大颗粒。
为规范和指导纳米药物研究与评价，在国家药品监督管理局的部署下，药审中心组织制定了《纳米药物质量控制研究技术指导原则（试行）》、《纳米药物非临床药代动力学研究技术指导原则（试行）》《纳米药物非临床安全性评价研究技术指导原则（试行）》三项关于纳米药物研究、质控、评价的技术指导原则。并由经国家药品监督管理局审查同意，8月27日予以发布通告，三项技术指导原则自发布之日起开始施行。
其中《纳米药物质量控制研究技术指导原则》主要内容是围绕着纳米药物的安全性、有效性以及质量可控性展开的。在这3方面，质量的可控性显得尤为重要，它一定程度上决定了药物的安全性和有效性。
该指导原则进一步将纳米药物细分为三类：药物纳米粒、载体类纳米药物以及其他类纳米药物，前两类药物适用于该指导原则。
在研发过程中，纳米药物的质量控制指标又可以分为纳米相关特性和制剂基本特性两大类。其中纳米相关特性是可能与药物在体内行为息息相关的重要质量指标。又包括例如平均粒径及其分布、纳米粒结构特征、微观形态、表面性质（电荷、比表面积等）包封率、载药量、纳米粒浓度、纳米粒稳定性等等。
质量控制指标涉及方面较多，本文重点关注以下三个方面的指标：
1. 粒径（平均粒径及其分布）
2. 表面电荷
3. 纳米粒浓度
在粒径表征方面，该指导意见原文如下：
「应选择适当的测定方法对纳米药物的粒径及分布进行研究，并进行完整的方法学验证及优化。粒径及分布通常采用动态光散射法（Dynamic light scattering，DLS）进行测定，需要使用经过认证的标准物质（Certified reference material，CRM）进行校验，测定结果为流体动力学粒径（Rh），粒径分布一般采用多分散系数（Polydispersity index，PDI）表示。除此之外，显微成像技术（如透射电镜（Transmission electron microscopy，TEM）、扫描电镜（Scanning electron microscopy，SEM）和原子力显微镜（Atomic force microscopy，AFM）、纳米颗粒跟踪分析系统 (Nanoparticle tracking analysis, NTA)、小角 X 射线散射（Small-angle X-ray scattering，SAXS）和小角中子散射（Small-angle neutron scattering，SANS）等也可提供纳米药物粒径大小的信息。对于非单分散的样品，可考虑将粒径测定技术与其它分散/分离技术联用。」
在了解动态光散射技术（DLS）之前，我们先来讲一讲粒径测量时的「等效球体」的概念。
想象一下，当我们完成颗粒粒径测试后，该如何用准确的数值来描述这些三维颗粒的大小呢？当颗粒是规则的形状时，比如说正方体、球体，我们可以用一个数值，例如：边长、直径，来表示这个颗粒的大小；但是，当颗粒呈现的形貌是无规则的话，我们就无法用一个数值来描述这个颗粒大小了，那有人会说，用一系列数值来描述这些颗粒不就行了吗，这个方法确实可行，但是随之带来了数据呈现的复杂度以及颗粒粒径大小比较的困难度。这个时候我们就必须引入「等效球体」概念了。
什么叫做等效球体呢？
当我们通过某种技术测量颗粒在某一方面的性质，并得到了一个具体的数值，如果一个刚性球体在该性质方面的数值和前者一样，那么我们就认为待测物的颗粒大小和这个刚性球的大小一致。
等效球体概念在粒径上的应用既能满足准确表示待测颗粒的粒径大小，又能使得这些数值能够被用来进行大小比较（单个数值）。
如图1 所示，我们可以得知，当一个不规则的颗粒采用不同的测量技术（沉降法、电阻法、体积法等等）去进行测量时，往往会得到不同的粒径值。
而我们说的动态光散射技术测量的是颗粒的扩散速度，所以，具有同样大小扩散速度的刚性球体的直径就是待测颗粒的粒径大小，我们一般称之为流体力学直径。
动态光散射
接着我们进一步来了解一下什么是 DLS 技术：
分散在溶液相的纳米颗粒由于受到溶剂分子的撞击，呈现出无规则的运动，我们称之为布朗运动（Brownian motion），如果我们将一束激光照射至含有该纳米颗粒的溶液中，溶液相中的颗粒会产生散射光，随后在一定的角度收集相关的散射光，我们就能得到如图2 所示的散射光强随时间的变化曲线，可以看出大颗粒布朗运动较为缓慢，散射光强的变化频率较慢（图2，上）。小颗粒则相反，由于其布朗运动剧烈，接收到的散射光强的变化频率较快（图2，下）。
而动态光散射技术则可以捕获上述散射光变化的频率，进而获得颗粒的布朗运动速率大小，最后通过反演算法获得颗粒的粒径和分布。
根据斯托克斯-爱因斯坦方程（Stokes-Einstein）的定义，我们可以看出，颗粒的运动速率是和它的粒径成反比的，运动速率越快，粒径越小，运动速率越慢，粒径越大。
该方程式：DH=KT/3πηD
K：玻尔兹曼常数
T：整个体系的绝对温度值
η：溶剂粘度值
D：颗粒平动扩散系数
那具体如何获得颗粒的布朗运动速率(D)呢？
接下来我们要引入「相关性」这个概念，如图3所示，如果我们将 t 时刻的散射光强度和其后较长时间的散射光强相比较，显然，他们没有什么相关性。但是，当我们将时间缩短至极短时间范围内，也就是将 t 和 t+δt 时刻的光强值进行比较，就能得到很强的相关性，随着时间的增加（δt, 2δt, 3δt, 等等)，其散射光强值和t时刻的相关性不断衰减，最后接近0值，相关性通常用数值来描述（1→0），数值越靠近「1」代表相关性非常高，越接近「0」代表相关性很低。δt 的时间非常短，一般在纳秒（nanosecond，ns）或者微秒（microsecond，μs）。
散射光强在不同时间点的相关性我们用 G (τ) 来表示：G (τ)=A[1+Bexp (-2Γτ)]
τ 代表着信号采集滞后时间
Γ=Dq2，
q=(4πn/λ0) sin(θ/2)，散射矢量
D：颗粒平动扩散系数
n：溶液的折光指数
λ0：入射光波长
θ：散射光接收角度
最后，我们用相关方程来描述这种相关性随时间的变化（图4），大颗粒的散射光强的相关性随时间变化慢，信号衰减慢（左），小颗粒的散射光强的相关性随时间变化快，信号衰减快（右）。
聊完了 DLS 的基本原理，我们再来看看大家比较关注的几个问题：
1. 什么是 Z-average size（平均粒径）、PI（polydispersity index，多分散指数）？
Z-average size 表示样品中颗粒的平均粒径大小，根据 ISO 13321:1996，我们可以知道，该数据是通过累计分析法得到的。
PI 代表着样品的粒径分布宽度，数值越小，说明体系里的粒径大小越一致，数值越大，说明体系里的粒径分布群体越多，粒径分布较宽，一般我们认为当 PI 值大于 0.7 时，表示这个体系不再适合用 DLS 这种技术进行表征了。
除了平均粒径和 PI，我们还能得到颗粒的光强粒径分布图，在这个分布图里，我们能得到不同粒径下对应的散射光强占比数据，这些分布图是根据分布算法得到的。
2. 如何看待不同测量角度下得到的粒径数据？
市面上主要存在两种测量角度的纳米粒度仪，分别是 90° 和 173°，前者我们称之为侧向角，后者我们称之为背向角。
当测试的样品为粒径窄分布时，例如聚苯yi烯标准样品，两种测量角度都能得到很好的粒径分布图，结果也非常一致（图5）。
当测试的样品为粒径宽分布时，比如一些生物样品，两种测量角度得到的粒径分布图就会有区别（见图6）。
这是为什么呢？
这其实是和颗粒的散射性质有关系的，当颗粒的粒径大小小于入射波段的 1/10 时，颗粒在各个方向上的散射光强度都一样，我们称之为各向同性，那么在这两个角度上进行测量，都能得到正确的数值。但是随着颗粒粒径的增加，颗粒在各个方向上的散射光强开始变得不一致，越靠近 0 度角，其散射光强增加越强烈，我们称之为各向异性。在绝大多数情况下，不同粒径的颗粒其散射强度在 90° 要比在 173° 要强一些，当体系中大颗粒开始变多时，来自于大颗粒的散射光强贡献度在 90° 角下就会比在 173° 角下要更多，因为粒径分布的数据是根据不同粒径的散射光强在整个体系的占比中得到的，所以在 90° 角下会使得颗粒的粒径分布更容易倾向于体系中存在的大颗粒。