【AAV 热点应用】Zetasizer 精准表征 rAAV 颗粒粒径及衣壳滴度

腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）是微小病毒科（Parvoviridae）家族的成员之一。其直径约为 20-26nm，含有 4.7kb 左右的线状单链 DNA。重组腺相关病毒载体（recombination AAV, rAAV）则是在非致病的野生型 AAV 基础上改造而成的，因其具有：安全性高、免疫原性低；宿主细胞范围广（对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力）；体内表达时间长；血清型众多，且具有组织特异性等特点被广泛用于基因治疗、疫苗等研究、应用领域 [1]。

在 rAAV 的生产工艺中，有无团聚体（aggregate），以及衣壳滴度（titer）的高低是重点考察的关键质量属性（CQAs）[2]，Zetasizer 纳米粒度仪通过对 rAAV 颗粒的粒径及衣壳滴度的表征，快速实现该 CQAs 的鉴定。

纳米粒度电位仪

马尔文帕纳科  Zetasizer Ultra

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材料和方法

将两种不同生产批次的 rAAV 分别用缓冲液稀释至合适的浓度，利用 Zetasizer Ultra-Red（Malvern Panalytical Ltd.）以及小体积石英比色皿（ZEN2112）进行相应的粒径和滴度测定 [3]。样品测试体积为 20 µL，rAAV 折射率、吸收率分别设置为 1.45 和 0.001，缓冲液的散射光强度测定为 80 kcps。

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结果

通过多角度动态光散射（multi-angle DLS, MADLS）技术，我们分别对两种批次的 rAAV 粒度大小及分布进行表征（图 1、3）。可以看到，批次 1 的 rAAV 只有一个粒径分布峰，其值大小为 28.2 nm，说明体系中没有团聚体产生，而批次 2 的 rAAV 则呈现出 3 个粒径分布峰，分别位于 28.2、150.9 以及 430.6 nm，这说明体系中除了 rAAV 单体，还有团聚体产生。

此外，基于 MADLS 技术得到的颗粒的准确粒径分布图，我们还能得到对应尺寸的衣壳滴度（图 2、4）。

参考文献

1. Mendell J R, Al-Zaidy S A, Rodino-Klapac L R, et al. Current Clinical Applications of in vivo Gene Therapy with AAVs. Molecular Therapy, 2021, 29 (2), 464-488.

2. Gimpel A L, Katsikis G, Sha S, et al. Analytical Methods for Process and Product Characterization of Recombinant Adeno-Associated Virus-based Gene Therapies. Molecular Therapy — Methods & Clinical Development, 2021, 20, 740-754.

3. Cole L, Fernandes D, Hussain M T, et al. Characterization of Recombinant Adeno-Associated Viruses (rAAVs) for Gene Therapy Using Orthogonal Techniques. Pharmaceutics, 2021, 13, 586.