【PNP】 聚合物纳米药物载体使用多检测器 SEC 分析的应用案例

纳米药物载体可实现靶向药物治疗。靶向给药治疗是指供助载体、配体或抗体将药物通过局部给药或全身血液循环而选择性地定位于靶组织、靶器官、靶细胞或细胞内结构的给药系统。在特定的导向机制作用下，纳米药物载体输送药物到特定靶点，发挥治疗作用，可达到药剂用量少、毒副作用低、药效持续、生物利用度高、长时间保持靶目标的有效药物浓度的效果。

在药学研究中，正确定位小分子药物的给药位置和控制药物释放曲线是一个关键的挑战。通过小分子药物与聚合物纳米载体偶联起来，在很大程度上实现细胞内精准靶向给药，在实际应用过程中有较好的效果。该方法既可用于控制药物释放曲线，又可用于控制药物释放位置，以最大限度地减少可能的副作用。

阿霉素（Doxorubicin）

阿霉素 (Dox) 是一种高效抗肿瘤抗生素，对肺癌、急慢性白血病等多种恶性肿瘤都有很强的细胞毒性，其机制是：通过将自身插入细胞的 DNA 碱基对中，破坏 DNA 的双螺旋结构，阻断 DNA 复制和 RNA 转录。通常是通过血液循环导入肿瘤细胞实现其抗肿瘤功能。

聚谷氨酸 (PG) 是一种以氨基酸谷氨酸为基础的具有生物相容性的聚合物。试验结果表明 Dox 和 PG 的偶联，可以实现靶向给药，提高药物在靶体内的聚集度，延长体内循环时间，降低毒副作用。

在本文中我们展示了马尔文帕纳科 OMNISEC 多检测器 SEC 如何对 PG、Dox 和两个 PG-Dox 偶联样品进行表征。这种先进的分析技术可用于研究药物加载效率和药物加载后发生的聚合物结构变化。

研究方法                

PG 和 PG-Dox 偶联物溶解在在 pH7.4 的 PBS 缓冲液中，通过 OMINISEC 进行样品的分离和检测。OMNISEC 是一个多检测器 SEC 系统，包括示差检测器 (RI)、紫外检测器 (UV)、光散射检测器 (LS) 和粘度检测器 (IV)。流动相为 PBS pH 7.4，含 30%(v/v) 甲醇水溶液；采用马尔文 A6000M 和 A3000 色谱柱分离。

检测结果与讨论               

测试 PG 样品和两个 PG-Dox 偶联物样品色谱图如图 1 所示，PG 的数值结果见表 1。PG 样品分离显示一个单峰，测得其平均分子量 (MW) 约为 13KDa。再看两个偶联样品，都分离出和 PG 具有相似保留体积的多峰。较早洗脱的光散射色谱图 (绿色，12-14 mL) 表明存在一些大的聚集体。而且，这些峰包含明显的紫外吸收信号，表明 Dox 的存在成功地偶联到聚合物上。

在图 2 A 中可以看到，在不同进样量下检测游离 Dox 的 UV 色谱图，可以看到游离的 Dox 从柱上洗脱得很晚，实际上已经在整个柱体积之后。这清楚地表明了 Dox 与色谱柱发生了显著的相互作用，延迟了 Dox 的洗脱。但从图 2 B 所示浓度响应曲线可以看出，尽管存在相互作用，回收率仍然接近 100%。该校准曲线用来测量存在于 PG-Dox 样品中的 Dox 的量。

如果我们确定 36 mL 处的峰为游离 Dox，这样 PG-Dox 样品中的相同位置峰也能确定为游离 Dox。如图 3 所示，可以清楚地确定偶联样品含有 PG-Dox 偶联物和游离 Dox。

使用图 2 B 中的浓度校准曲线，可以计算偶联样品中存在的 Dox 量。如表 2 所示，两种 PG-Dox 偶联物都含有游离的 Dox。在一次注射体积中，PG-Dox 1 的偶联物中含有大约 11 μg 的 Dox，而 PG-Dox 2 的偶联物中含有大约 39 μg 的 Dox。然后，可以计算出样品中注入的总 Dox 质量和 Dox 浓度。然后，可以根据溶解物质的质量计算出近似的总样品浓度。这样就可以计算每个 PG-Dox 偶联物中 Dox 的近似负载量。由此可以近似地看出，样品 2 的偶联物中含有的 Dox 是样品 1 的三倍。

我们可以对 PG-Dox 偶联物进一步表征（其中 dn/dc 假设分析），计算偶联聚合物的近似分子量、特性粘度和结构数据，如表 3 所示。

​Mark-Houwink(M-H 图) 显示了特性粘度作为分子量的函数，是分子间结构差异的直观表示。在溶液中密度较高的聚合物在 M-H 图上看起来较低，用来研究结构变化，如支化、偶联等结构变化。图 4 显示了 3 个样本的 M-H 图。首先，这两个 PG-Dox 偶联物 M-H 曲线显著低于单独的 PG。这是我们预料中的，因为药物分子的偶联将增加聚合物在溶液中的表观密度，并且具有更大 Dox 负载量的样品将进一步向下移动。PG-Dox 1 和 PG-Dox 2 之间的斜率不同，说明 Dox 负载量可能不是随分子量均匀分布的。

结论                   

本文展示了如何将多检测器 SEC 用于高分子聚合物偶联小分子药物传递表征分析的方法。在相同的测试条件下，对原聚合物、游离药物 (Dox) 和两种偶联产物进行了表征。药物的紫外吸光度使得可以测量负载水平和评估两种偶联物的偶联水平。通过假设分析，偶联分子量和结构也可以测量并相互比较。

小分子药物的输送在实际应用中面临许多挑战，与较大的聚合物偶联是提高药物定位和载药量的一种策略，但要获得可靠和可重复的结果，需要先进的表征方法。通过使用 OMNISEC 这样的多检测器系统进行分析，研究人员可以更好地表征和研究，从而控制附着在聚合物纳米输送载体上的药物量以及产品的分子量和结构，以实现最佳的药物输送效率。